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western blot 的原理及操作步骤、应用有哪些?

作者:king发布时间:2024-06-13分类:日常百科浏览:505


导读:今天哈哈社小编给各位讲解下wb检测方法的意思,也会对westernblot的原理及操作步骤、应用有哪些?进行解释,如果能碰巧解决你现在面临的问题,别忘了关注本站,现在我们开始吧...
今天哈哈社小编给各位讲解下wb检测方法的意思,也会对western blot 的原理及操作步骤、应用有哪些?进行解释,如果能碰巧解决你现在面临的问题,别忘了关注本站,现在我们开始吧! western blot 的原理及操作步骤、应用有哪些?原理
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素膜NC膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
操作步骤
(一)蛋白质样品获得:细菌诱导表达后,可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞,真核细胞加匀浆缓冲液,机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃,13,000g离心15min。取上清液作为样品。
(二)电泳:制备电泳凝胶,进行SDS-PAGE。
(三)转移:(半干式转移)
1、电泳结束后将胶条割至合适大小,用转膜缓冲液平衡,5min×3次。
2、膜处理:预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜,浸入转膜缓冲液中10min。
3、转膜:转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好,滤纸、凝胶、NC膜精确对齐,每一步去除气泡,上压500g重物,将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2,转移1.5hr。转移结束后,断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色,放入膜染色液中50s后,在50%甲醇中多次脱色,至背景清晰,然后用双蒸水洗,风干夹于两层滤纸中保存,留与显色结果作对比。
(四)免疫反应:
1、用0.01M PBS洗膜,5min ×3次。
2、加入包被液,平稳摇动,室温2hr。
3、弃包被液,用0.01M PBS洗膜,5min×3次。
4、加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释,液体必须覆盖膜的全部),4℃ 放置12hr以上。阴性对照,以1%BSA取代一抗,其余步骤与实验组相同。
5、弃一抗和1%BSA,用0.01M PBS分别洗膜,5min×4次。
6、加入辣根过**物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释),平稳摇动,室温2hr。
7、弃二抗,用0.01M PBS洗膜,5min×4次。
8、加入显色液,避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
四、注意事项
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用,最后加入H2O2。
3、DAB有致癌的潜在可能,操作时要小心仔细。初筛实验室和确认实验有什么区别?western blot 的原理及操作步骤、应用有哪些?有区别,医院是初筛实验室,只能够做初筛,筛出来阳性病人。有时候病人到一个医院来检测之后,觉得你实验不准,检测阳性了,在医院会用不同的方法检测两次,如果还是阳性,就会把血由送到确认实验室,确认回来的报告我们再告诉病人。只有确认报告下来了,才能给病人一个确定的诊断报告。做wb时,一抗和二抗浓度是怎么确定的?怎么设置抗体滴度  一抗的用量和样品中的目标分子含量相关,如果含量较高,就不需要用太多一抗,以免浪费和条带太亮不易分析。推荐采用厂家的抗体浓度(义翘神州会提供抗体用量、天然细胞株检测结果),如果样品与厂家的不是一种细胞,可以尝试上下摸索一两个浓度梯度;
  二抗的用量,和你所在实验室常规的用量就可以,如果出现效果不理想的状态,二抗的作用可以通过阳性对照和阴性对照、以及其他人的使用效果看出来有没有问题。我用FLAG单抗做western blot, 检测不到含FLAG标签的目的蛋白,你觉得是为什么呢?这个Flag标签抗体能检测到其他带Flag标签的蛋白吗?
例如空载对照。如果空载也不行,那基本抗体就歇了。
如果有,就要看Flag标签是不是正确表达了,如果表达不正确也会影响到检测的。RT-PCR,Western blot和ELISA三者的区别RT-PCR我想你应该说的是Real time PCR或者Q-PCR吧,它主要是在转录水平研究目的基因表达的情况,一定程度上可以反映蛋白最终的表达量。
WB和ELISA还有IHC(免疫组化)是目前国际上研究蛋白的主要手段和方法,他们三个分别用于蛋白的定性,定量和定位。当然WB既可以定性又可以半定量蛋白,既可以研究细胞又适用于组织,是目前最常用的蛋白检测方法。ELISA主要检测液态的样本,是定量较准确的方法。IHC可以直观看到细胞表达情况,是在核内还是核外,定位的最好方法。
希望能够帮助你。Western 实验中常用的显色方法有哪些?为什么发文章都用ECL方法?Western是初步鉴定蛋白质最方便也是最通用的方法。显色方法主要有:放射自显影,底物化学发光ECL,底物荧光ECF,底物DAB,现在常用的有ECL和底物DAB,目前发表文章通常用ECL,只要买现成的试剂盒就可以,操作简单,二抗用HRP标记,底物为过**物+鲁米诺,如果遇到HRP即可发光,可使胶片曝光,洗出条带。在凝胶图像分析仪上进行灰度扫描,比较目的蛋白与内参照蛋白的灰度值,可以半定量分析。我们实验室就一直用这种方法,开始用的millipore的试剂盒,后来用的炎熙生物的极敏型ECL试剂盒,灵敏度很高。对一些表达不高的蛋白非常适用。疾控中心做的胶体硒阳性WB无特异带型结论阴性你查的是HIV吧,目前HIV检查大致分成两类一类是初筛试验,一类是确证试验。为了保证初筛时漏检,所以初筛试验灵敏度比较高,生物学假阳性随之增加,胶体金法属于快速试纸法,这种试验快速便捷,美中不足假阳性比较多,所以阳性还要使用WB进行确证。
不管初筛试验是否阳性,最终的结果以确证WB试验为准。你说的这个情况一无高危,二来确证试验是阴性的,所以可以排除HIV了。哈哈社推荐内容:海口买房哪个区比较好达芬奇预言的介绍尼罗河经过哪几个国家河流德国厨具品牌有哪些?“宋”在百家姓里排第几位求百合动漫,一定要有热吻的,谢谢尼泊尔处于哪几个板块交界处呢请问,香港恐怖电影排行前十有哪些?西安封城顺风几天到宝鸡凌波鱼是淡水鱼吗?黑白相间的格子春装长裤配什么衣服好看? 我15岁25027《兰亭集序》究竟在谁的墓里?